בדיקת מתילציה של DNA בשילוב עם סמארטפונים לגילוי מוקדם של גידולים ולוקמיה בדיוק של 90.0%!

גילוי מוקדם של סרטן המבוסס על ביופסיה נוזלית הוא כיוון חדש של גילוי ואבחון סרטן שהוצע על ידי המכון הלאומי לסרטן בארה"ב בשנים האחרונות, במטרה לזהות סרטן מוקדם או אפילו נגעים טרום סרטניים. הוא נמצא בשימוש נרחב כסמן ביולוגי חדש לאבחון מוקדם של מגוון גידולים ממאירים, כולל סרטן ריאות, גידולים במערכת העיכול, גליומות וגידולים גינקולוגיים.

להופעתן של פלטפורמות לזיהוי סמנים ביולוגיים של מתילציה (Methylscape) יש פוטנציאל לשפר משמעותית את הסינון המוקדם הקיים לסרטן, ולהציב את החולים בשלב המוקדם ביותר הניתן לטיפול.

לאחרונה, חוקרים פיתחו פלטפורמת חישה פשוטה וישירה לגילוי נוף מתילציה המבוססת על ננו-חלקיקי זהב מעוטרים בציסטאמין (Cyst/AuNPs) בשילוב עם ביוסנסור מבוסס סמארטפון המאפשר סינון מוקדם ומהיר של מגוון רחב של גידולים. סינון מוקדם ללוקמיה יכול להתבצע תוך 15 דקות לאחר נטילת DNA מדגימת דם, עם דיוק של 90.0%. כותרת המאמר היא זיהוי מהיר של DNA סרטני בדם אנושי באמצעות AuNPs מכוסי ציסטאמין וסמארטפון מבוסס למידת מכונה.

איור 1. פלטפורמת חישה פשוטה ומהירה לבדיקת סרטן באמצעות רכיבי ציסטה/אאונפסי ננו-חלקיקים ניתנת להשגה בשני שלבים פשוטים.

זה מוצג באיור 1. ראשית, נעשה שימוש בתמיסה מימית כדי להמיס את שברי ה-DNA. לאחר מכן נוספו לתמיסה המעורבבת ציסטות/אאונ-חלקיקים (Cyst/AuNPs). ל-DNA תקין ול-DNA ממאיר יש תכונות מתילציה שונות, וכתוצאה מכך נוצרים שברי DNA עם דפוסי הרכבה עצמית שונים. DNA תקין מתאגרף באופן רופף ובסופו של דבר מתאגרף בציסטות/אאונ-חלקיקים, מה שמביא לאופי ההסחה לאדום של ציסטות/אאונ-חלקיקים, כך שניתן לראות שינוי צבע מאדום לסגול בעין בלתי מזוינת. לעומת זאת, פרופיל המתילציה הייחודי של DNA סרטני מוביל לייצור צברים גדולים יותר של שברי DNA.

תמונות של פלטות 96 בארות צולמו באמצעות מצלמת סמארטפון. דנ"א סרטני נמדד באמצעות סמארטפון המצויד בלמידת מכונה בהשוואה לשיטות מבוססות ספקטרוסקופיה.

בדיקת סרטן בדגימות דם אמיתיות

כדי להרחיב את התועלת של פלטפורמת החישה, החוקרים השתמשו בחיישן שהבחין בהצלחה בין DNA תקין לסרטני בדגימות דם אמיתיות. דפוסי מתילציה באתרי CpG מווסתים באופן אפיגנטי את ביטוי הגנים. כמעט בכל סוגי הסרטן, נצפו שינויים במתילציה של DNA ולכן בביטוי של גנים המקדמים יצירת גידולים, מתחלפים.

כמודל לסוגי סרטן אחרים הקשורים למתילציה של DNA, החוקרים השתמשו בדגימות דם מחולי לוקמיה ומקבוצת ביקורת בריאה כדי לחקור את יעילותה של מערכת המתילציה בהבחנה בין סוגי סרטן לויקמיים. סמן ביולוגי זה של מערכת המתילציה לא רק עולה בביצועיו על שיטות סינון מהירות קיימות ללוקמיה, אלא גם מדגים את היתכנות ההרחבה לגילוי מוקדם של מגוון רחב של סוגי סרטן באמצעות בדיקה פשוטה וישירה זו.

נותח DNA מדגימות דם מ-31 חולי לוקמיה ו-12 אנשים בריאים. כפי שמוצג בתרשים הקופסאות באיור 2א', הבליעה היחסית של דגימות הסרטן (ΔA650/525) הייתה נמוכה יותר מזו של DNA מדגימות רגילות. זאת בעיקר בשל הידרופוביות מוגברת שהובילה לאגרגציה צפופה של DNA סרטני, שמנעה את הצטברות הציסטות/אאונ-חלקיקים. כתוצאה מכך, חלקיקים ננו אלה פוזרו לחלוטין בשכבות החיצוניות של אגרגטים של הסרטן, מה שהביא לפיזור שונה של ציסטות/אאונ-חלקיקים שנספחו על אגרגטים של DNA רגיל וסרטני. לאחר מכן נוצרו עקומות ROC על ידי שינוי הסף מערך מינימלי של ΔA650/525 לערך מקסימלי.

איור 2. (א) ערכי ספיגה יחסיים של תמיסות ציסטה/AuNPs המראים נוכחות של DNA תקין (כחול) וסרטני (אדום) בתנאים אופטימליים.

(DA650/525) של תרשימי קופסאות; (ב) ניתוח ROC והערכת בדיקות אבחון. (ג) מטריצת בלבול לאבחון חולי סרטן וחולים בריאים. (ד) רגישות, ספציפיות, ערך ניבוי חיובי (PPV), ערך ניבוי שלילי (NPV) ודיוק השיטה שפותחה.

כפי שמוצג באיור 2b, השטח מתחת לעקומת ROC (AUC = 0.9274) שהתקבל עבור החיישן שפותח הראה רגישות וספציפיות גבוהות. כפי שניתן לראות מתרשים הקופסאות, הנקודה הנמוכה ביותר המייצגת את קבוצת ה-DNA הנורמלית אינה מופרדת היטב מהנקודה הגבוהה ביותר המייצגת את קבוצת ה-DNA הסרטני; לכן, נעשה שימוש ברגרסיה לוגיסטית כדי להבדיל בין קבוצות הנורמליות לקבוצות הסרטן. בהינתן קבוצה של משתנים בלתי תלויים, היא מעריכה את ההסתברות להתרחשות אירוע, כגון קבוצת סרטן או קבוצה נורמלית. המשתנה התלוי נע בין 0 ל-1. לכן, התוצאה היא הסתברות. קבענו את ההסתברות לזיהוי סרטן (P) בהתבסס על ΔA650/525 באופן הבא.

כאשר b=5.3533,w1=-6.965. עבור סיווג מדגם, הסתברות נמוכה מ-0.5 מצביעה על מדגם תקין, בעוד שהסתברות של 0.5 ומעלה מצביעה על מדגם סרטני. איור 2ג' מתאר את מטריצת הבלבול שנוצרה מהאימות הצולב של "השאירו את זה לבד", אשר שימש לאימות יציבות שיטת הסיווג. איור 2ד' מסכם את הערכת הבדיקה האבחונית של השיטה, כולל רגישות, ספציפיות, ערך ניבוי חיובי (PPV) וערך ניבוי שלילי (NPV).

ביוסנסורים מבוססי סמארטפון

כדי לפשט עוד יותר את בדיקת הדגימות ללא שימוש בספקטרופוטומטרים, החוקרים השתמשו בבינה מלאכותית (AI) כדי לפרש את צבע התמיסה ולהבחין בין אנשים בריאים לסרטניים. לאור זאת, ראייה ממוחשבת שימשה לתרגום צבע תמיסת Cyst/AuNPs ל-DNA רגיל (סגול) או DNA סרטני (אדום) באמצעות תמונות של לוחות 96 בארות שצולמו דרך מצלמת טלפון נייד. בינה מלאכותית יכולה להפחית עלויות ולשפר את הנגישות בפירוש צבען של תמיסות ננו-חלקיקים, וללא שימוש באביזרים אופטיים לחומרה חכמה. לבסוף, שני מודלים של למידת מכונה, כולל Random Forest (RF) ו-Support Vector Machine (SVM), אומנו לבניית המודלים. גם המודלים RF וגם המודלים SVM סיווגו נכון את הדגימות כחיוביות ושליליות בדיוק של 90.0%. ממצא זה מצביע על כך שהשימוש בבינה מלאכותית בביוסנסינג מבוסס טלפונים ניידים הוא בהחלט אפשרי.

איור 3. (א) סוג המטרה של התמיסה שנרשמה במהלך הכנת הדגימה לשלב רכישת התמונה. (ב) תמונה לדוגמה שצולמה במהלך שלב רכישת התמונה. (ג) עוצמת הצבע של תמיסת הציסטה/AuNPs בכל באר של צלחת 96 הבארות שחולצה מהתמונה (ב).

באמצעות ציסטות/AuNPs, חוקרים פיתחו בהצלחה פלטפורמת חישה פשוטה לגילוי נוף מתילציה וחיישן המסוגל להבחין בין DNA תקין ל-DNA סרטני בעת שימוש בדגימות דם אמיתיות לבדיקת לוקמיה. החיישן שפותח הדגים כי DNA שחולץ מדגימות דם אמיתיות הצליח לזהות במהירות ובעלות-תועלת כמויות קטנות של DNA סרטני (3nM) בחולי לוקמיה תוך 15 דקות, והראה דיוק של 95.3%. כדי לפשט עוד יותר את בדיקת הדגימות על ידי ביטול הצורך בספקטרופוטומטר, נעשה שימוש בלמידת מכונה כדי לפרש את צבע התמיסה ולהבדיל בין אנשים תקינים לסרטניים באמצעות תצלום מטלפון נייד, ודיוק נוסף הושג של 90.0%.

הפניה: DOI: 10.1039/d2ra05725e