בדיקת מתילציה של DNA בשילוב סמארטפונים להקרנה מוקדמת של גידולים ובדיקת לוקמיה בדיוק של 90.0%!

גילוי מוקדם של סרטן על בסיס ביופסיה נוזלית הוא כיוון חדש לגילוי ואבחון סרטן שהוצע על ידי המכון הלאומי לסרטן בארה"ב בשנים האחרונות, במטרה לאתר סרטן מוקדם או אפילו נגעים טרום סרטניים. הוא נמצא בשימוש נרחב כסמן ביולוגי חדש לאבחון מוקדם של גידולים ממאירים שונים, כולל סרטן ריאות, גידולים במערכת העיכול, גליומות וגידולים גינקולוגיים.

להופעתם של פלטפורמות לזיהוי סמנים ביולוגיים של נוף מתילציה (Methylscape) יש פוטנציאל לשפר משמעותית את ההקרנה המוקדמת הקיימת לסרטן, ולהעמיד את החולים בשלב המוקדם ביותר שניתן לטפל בו.

לאחרונה, חוקרים פיתחו פלטפורמת חישה פשוטה וישירה לזיהוי נוף מתילציה המבוססת על ננו-חלקיקי זהב מעוטרים בציסטאמין (Cyst/AuNPs) בשילוב עם ביוחיישן מבוסס סמארטפון המאפשר בדיקה מוקדמת מהירה של מגוון רחב של גידולים. בדיקה מוקדמת ללוקמיה יכולה להתבצע תוך 15 דקות לאחר שאיבת DNA מדגימת דם, עם דיוק של 90.0%. כותרת המאמר היא זיהוי מהיר של DNA סרטני בדם אנושי באמצעות AuNPs עם כיסוי ציסטיאמין וסמארטפון התומך למידת מכונה.

איור 1. פלטפורמת חישה פשוטה ומהירה להקרנת סרטן באמצעות רכיבי ציסטה/AuNPs יכולה להתבצע בשני שלבים פשוטים.

זה מוצג באיור 1. ראשית, נעשה שימוש בתמיסה מימית כדי להמיס את שברי ה-DNA. לאחר מכן נוספו ציסטות/AuNP לתמיסה המעורבת. ל-DNA רגיל וממאיר יש תכונות מתילציה שונות, וכתוצאה מכך נוצרים שברי DNA עם דפוסי הרכבה עצמית שונים. DNA תקין מתקבץ באופן רופף ובסופו של דבר צובר ציסטות/AuNPs, מה שגורם לשינוי באדום של ציסטה/AuNP, כך שניתן לראות שינוי בצבע מאדום לסגול בעין בלתי מזוינת. לעומת זאת, פרופיל המתילציה הייחודי של DNA סרטני מוביל לייצור של צבירים גדולים יותר של שברי DNA.

תמונות של צלחות 96 באר צולמו באמצעות מצלמת סמארטפון. DNA של סרטן נמדד על ידי סמארטפון המצויד בלמידת מכונה בהשוואה לשיטות מבוססות ספקטרוסקופיה.

בדיקת סרטן בדגימות דם אמיתיות

כדי להרחיב את התועלת של פלטפורמת החישה, החוקרים הפעילו חיישן שהבחין בהצלחה בין DNA תקין לסרטני בדגימות דם אמיתיות. דפוסי מתילציה באתרי CpG מווסתים אפיגנטית את ביטוי הגנים. כמעט בכל סוגי הסרטן, נצפו שינויים במתילציה של ה-DNA ובכך בביטוי של גנים המעודדים גידול גידולים.

כמודל לסוגי סרטן אחרים הקשורים למתילציה של DNA, החוקרים השתמשו בדגימות דם מחולי לוקמיה ובקרות בריאות כדי לחקור את היעילות של נוף המתילציה בהבחנה בין סוגי סרטן לוקמיה. סמן ביולוגי זה של נוף מתילציה לא רק עולה על שיטות הסקר המהירות הקיימות של לוקמיה, אלא גם מדגים את ההיתכנות של הרחבה לגילוי מוקדם של מגוון רחב של סוגי סרטן באמצעות בדיקה פשוטה ופשוטה זו.

נותח DNA מדגימות דם מ-31 חולי לוקמיה ו-12 אנשים בריאים. כפי שמוצג בתרשים הקופסה באיור 2a, הספיגה היחסית של דגימות הסרטן (ΔA650/525) הייתה נמוכה מזו של DNA מדגימות רגילות. זה נבע בעיקר מהידרופוביות המוגברת שהובילה לצבירה צפופה של DNA סרטני, שמנעה את הצטברות של Cyst/AuNPs. כתוצאה מכך, ננו-חלקיקים אלו התפזרו לחלוטין בשכבות החיצוניות של אגרגטים הסרטניים, מה שהביא לפיזור שונה של Cyst/AuNPs שנספחו על אגרגטים של DNA נורמלי וסרטני. לאחר מכן נוצרו עקומות ROC על ידי שינוי הסף מערך מינימלי של ΔA650/525 לערך מקסימלי.

איור 2.(א) ערכי ספיגה יחסיים של פתרונות ציסטה/AuNPs המראים נוכחות של DNA תקין (כחול) וסרטן (אדום) בתנאים אופטימליים

(DA650/525) של חלקות קופסה; (ב) ניתוח ROC והערכה של בדיקות אבחון. (ג) מטריצת בלבול לאבחון של חולי נורמלי וסרטן. (ד) רגישות, ספציפיות, ערך ניבוי חיובי (PPV), ערך ניבוי שלילי (NPV) ודיוק השיטה שפותחה.

כפי שמוצג באיור 2b, השטח מתחת לעקומת ROC (AUC = 0.9274) שהתקבל עבור החיישן שפותח הראה רגישות וסגוליות גבוהות. כפי שניתן לראות מעלילת הקופסה, הנקודה הנמוכה ביותר המייצגת את קבוצת ה-DNA הרגיל אינה מופרדת היטב מהנקודה הגבוהה ביותר המייצגת את קבוצת ה-DNA הסרטני; לכן, נעשה שימוש ברגרסיה לוגיסטית כדי להבדיל בין הקבוצות הנורמליות והסרטניות. בהינתן קבוצה של משתנים בלתי תלויים, הוא מעריך את ההסתברות להתרחשות של אירוע, כגון סרטן או קבוצה נורמלית. המשתנה התלוי נע בין 0 ל-1. לכן התוצאה היא הסתברות. קבענו את ההסתברות לזיהוי סרטן (P) בהתבסס על ΔA650/525 כדלקמן.

כאשר b=5.3533,w1=-6.965. עבור סיווג מדגם, הסתברות של פחות מ-0.5 מציינת מדגם תקין, בעוד שהסתברות של 0.5 ומעלה מציינת מדגם סרטן. איור 2c מתאר את מטריצת הבלבול שנוצרה מאימות ההצלבה להשאיר את זה לבד, אשר שימש לאימות היציבות של שיטת הסיווג. איור 2d מסכם את הערכת הבדיקה האבחנתית של השיטה, כולל רגישות, ספציפיות, ערך ניבוי חיובי (PPV) וערך ניבוי שלילי (NPV).

חיישנים ביולוגיים מבוססי סמארטפון

כדי לפשט עוד יותר את בדיקת הדגימה ללא שימוש בספקטרופוטומטרים, החוקרים השתמשו בבינה מלאכותית (AI) כדי לפרש את צבע התמיסה ולהבחין בין אנשים נורמליים לסרטניים. בהתחשב בכך, נעשה שימוש בראייה ממוחשבת כדי לתרגם את הצבע של תמיסת הציסטה/AuNPs ל-DNA רגיל (סגול) או ל-DNA סרטני (אדום) באמצעות תמונות של לוחות 96-בארים שצולמו דרך מצלמת טלפון נייד. בינה מלאכותית יכולה להוזיל עלויות ולשפר את הנגישות בפירוש הצבע של פתרונות ננו-חלקיקים, וללא שימוש באביזרים אופטיים לסמארטפון חומרה. לבסוף, שני מודלים של למידת מכונה, כולל Random Forest (RF) ו- Support Vector Machine (SVM) הוכשרו לבניית המודלים. גם מודל ה-RF וגם ה-SVM סיווגו נכון את הדגימות כחיוביות ושליליות עם דיוק של 90.0%. זה מצביע על כך שהשימוש בבינה מלאכותית בחישה ביולוגית מבוססת טלפונים ניידים אפשרי בהחלט.

איור 3. (א) כיתת היעד של הפתרון שנרשם במהלך הכנת המדגם לשלב רכישת התמונה. (ב) תמונה לדוגמה שצולמה במהלך שלב רכישת התמונה. (ג) עוצמת הצבע של פתרון הציסטה/AuNPs בכל באר של צלחת 96-באר שחולצה מהתמונה (ב).

באמצעות Cyst/AuNPs, חוקרים פיתחו בהצלחה פלטפורמת חישה פשוטה לזיהוי נוף מתילציה וחיישן המסוגל להבחין בין DNA תקין ל-DNA סרטני בעת שימוש בדגימות דם אמיתיות לבדיקת לוקמיה. החיישן שפותח הוכיח ש-DNA שהופק מדגימות דם אמיתיות מסוגל לזהות במהירות ובעלות-תועלת כמויות קטנות של DNA סרטני (3nM) בחולי לוקמיה תוך 15 דקות, והראה דיוק של 95.3%. כדי לפשט עוד יותר את בדיקות המדגם על ידי ביטול הצורך בספקטרופוטומטר, נעשה שימוש בלמידת מכונה כדי לפרש את צבע התמיסה ולהבדיל בין אנשים נורמליים לסרטניים באמצעות צילום טלפון נייד, וניתן היה להשיג דיוק גם ב-90.0%.

הפניה: DOI: 10.1039/d2ra05725e