גורמי הפרעה בתגובות PCR

במהלך תגובת ה- PCR, לרוב נתקלים בגורמים מפריעים.
בשל הרגישות הגבוהה ביותר של PCR, הזיהום נחשב לאחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על תוצאות ה- PCR ויכול להביא לתוצאות חיוביות כוזבות.
קריטיים לא פחות הם המקורות השונים המובילים לתוצאות שליליות כוזבות. אם חלק אחד או יותר חיוני בתערובת ה- PCR או בתגובת ההגברה עצמה נעצרים או מפריעים, ניתן להפריע למבחן האבחון. זה יכול להוביל ליעילות מופחתת ואפילו לתוצאות שליליות כוזבות.
בנוסף לעיכוב, אובדן של שלמות חומצת גרעין יעד עשוי להתרחש כתוצאה מתנאי משלוח ו/או אחסון לפני הכנת הדגימה. בפרט, טמפרטורות גבוהות או אחסון לא מספק עלולים להוביל לפגיעה בתאים וחומצות גרעין. קיבוע תאים ורקמות והטמעת פרפין הם גורמים ידועים לפיצול DNA ובעיה מתמשכת (ראה איורים 1 ו -2). במקרים אלה, אפילו בידוד וטיהור אופטימלי לא יעזרו.

איור 1 | השפעת התנעה על שלמות ה- DNA
אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז הראה כי איכות ה- DNA המבודדת מקטעי פרפין של נתיחות שלאחר המוות השתנתה במידה ניכרת. DNA באורכי שבר ממוצעים שונים היה קיים בתמציות בהתאם לשיטת הקיבוע. ה- DNA נשמר רק כאשר הוא קבוע בדגימות קפואות ילידיות ובפורמלין ניטרלי חוצץ. השימוש בקיבוע חומצי חומצי מאוד או פורמלין הפורמי המכיל חומצה פורמלין, הביא לאובדן משמעותי של DNA. השבר הנותר מקוטע מאוד.
משמאל, אורך השברים בא לידי ביטוי בזוגות קילובאז (KBP)

איור 2 | אובדן שלמות יעדי חומצות גרעין
(א) פער 3′-5 ′ בשני הגדילים יביא להפסקה ב- DNA היעד. סינתזה של DNA עדיין תתרחש על השבר הקטן. עם זאת, אם אתר חישול פריימר חסר בשבר ה- DNA, מתרחשת רק הגברה ליניארית. במקרה החיובי ביותר, השברים עשויים לקבוע זה את זה מחדש, אך התשואות יהיו קטנות ומתחת לרמות הגילוי.
(ב) אובדן בסיסים, בעיקר כתוצאה מהתפגנות ויצירת תימידין דימר, מוביל לירידה במספר קשרי ה- H וירידה ב- TM. בשלב ההתחממות המוארך, הפריימרים יימסו מה- DNA של המטריצה ​​ולא יבטלו אפילו בתנאים פחות מחמירים.
(ג) בסיסי תימין סמוכים יוצרים דימר TT.
בעיה שכיחה נוספת המתרחשת לעתים קרובות באבחון מולקולרי היא השחרור הפחות אופטימלי של חומצות גרעין יעד בהשוואה למיצוי פנול-כלורופורם. במקרים קיצוניים זה יכול להיות קשור לשליליות שווא. ניתן לחסוך זמן רב על ידי תמוגה רותחת או עיכול אנזימטי של פסולת תאים, אך שיטה זו גורמת לרוב לרגישות נמוכה של PCR כתוצאה משחרור חומצה גרעינית לא מספקת.

עיכוב פעילות פולימראז במהלך הגברה

באופן כללי, עיכוב משמש כמושג מכולות לתיאור כל הגורמים המובילים לתוצאות PCR תת -אופטימליות. במובן הביוכימי הקפדני, העכבה מוגבלת לפעילות של האנזים, כלומר, היא מקטינה או מונעת המרה של מוצר מצע באמצעות אינטראקציה עם האתר הפעיל של הפולימראז DNA או הקופקטור שלו (EG, MG2+ עבור TAQ DNA פולימראז).
רכיבים במדגם או במאגר ותמציות שונות המכילות ריאגנטים יכולים לעכב ישירות את האנזים או ללכוד את הקופקטורים שלו (למשל EDTA), ובכך להפעיל את הפולימראז ובתורם להוביל לירידה בתוצאות PCR שליליות או שווא.
עם זאת, אינטראקציות רבות בין רכיבי תגובה לחומצות גרעין המכילות יעד מוגדרים גם כ'מעכבי PCR '. לאחר שיבוש שלמות התא מופרע על ידי בידוד וחומצת הגרעין משתחררת, יכולות להתרחש אינטראקציות בין המדגם לתמיסה הסובבת ושלב המוצק. לדוגמה, 'נבלות' יכולים לקשור DNA חד-גדילי או כפול באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות ולהפריע לבידוד וטיהור על ידי הפחתת מספר המטרות שמגיעות בסופו של דבר לכלי התגובה של PCR.
באופן כללי, מעכבי PCR קיימים ברוב נוזלי הגוף והריגנטים המשמשים לבדיקות אבחון קליניות (אוריאה בשתן, המוגלובין והפרין בדם), תוספי תזונה (רכיבים אורגניים, גליקוגן, שומן, יוני Ca2+) ומרכיבים בסביבה (פנולים, מתכות כבדות)

ניתן למצוא מעכבי PCR נפוצים יותר בחיידקים ובתאים אוקריוטיים, DNA שאינו יעד, מקרומולקולות הקשורות ל- DNA של מטריצות רקמות וציוד מעבדה כמו כפפות ופלסטיקה. טיהור חומצות גרעין במהלך מיצוי או אחריו הוא השיטה המועדפת להסרת מעכבי PCR.
כיום, ציוד מיצוי אוטומטי שונה יכול להחליף פרוטוקולים ידניים רבים, אך מעולם לא הושגה התאוששות ו/או טיהור של 100% של יעדים. מעכבים פוטנציאליים עשויים עדיין להופיע בחומצות הגרעין המטוהרות או שאולי כבר נכנסו לתוקף. קיימות אסטרטגיות שונות כדי להפחית את ההשפעה של מעכבים. הבחירה בפולימראז המתאימה יכולה להשפיע משמעותית על פעילות המעכב. שיטות מוכחות אחרות להפחתת עיכוב ה- PCR מגדילות את ריכוז הפולימראז או יישום תוספים כמו BSA.
ניתן להדגים עיכוב של תגובות PCR על ידי שימוש בבקרת איכות תהליכים פנימית (IPC).
יש להקפיד להסיר את כל הריאגנטים והפתרונות האחרים בערכת המיצוי, כמו אתנול, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, איזופרופנול ופנול, מבודד חומצה גרעין על ידי שלב כביסה יסודי. תלוי בריכוזם, הם עשויים להפעיל או לעכב PCR.