גורמי הפרעה בתגובות PCR

במהלך תגובת ה-PCR, נתקלים לעיתים קרובות בגורמים מפריעים.
בשל הרגישות הגבוהה מאוד של PCR, זיהום נחשב לאחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על תוצאות PCR ויכול לייצר תוצאות חיוביות שגויות.
קריטיים לא פחות הם המקורות השונים המובילים לתוצאות שליליות שגויות. אם אחד או יותר ממרכיבים חיוניים של תערובת ה-PCR או תגובת ההגברה עצמה מעוכבים או מופרעים, הבדיקה האבחנתית עלולה להיפגע. זה יכול להוביל ליעילות מופחתת ואף לתוצאות שליליות שגויות.
בנוסף לעיכוב, אובדן שלמות חומצת הגרעין של המטרה עלול להתרחש עקב תנאי משלוח ו/או אחסון לפני הכנת הדגימה. בפרט, טמפרטורות גבוהות או אחסון לא מספק עלולים להוביל לנזק לתאים ולחומצות גרעין. קיבוע תאים ורקמות והטבעת פרפין הם גורמים ידועים לפיצול DNA ובעיה מתמשכת (ראה איורים 1 ו-2). במקרים אלה, אפילו בידוד וניקוי אופטימליים לא יעזרו.

איור 1 | השפעת קיבוע על שלמות ה-DNA
אלקטרופורזה בג'ל אגרוז הראתה שאיכות ה-DNA שבודד מחתכי פרפין של נתיחות שלאחר המוות השתנתה במידה ניכרת. DNA באורכים ממוצעים שונים של מקטעים נמצא בתמציות בהתאם לשיטת הקיבוע. ה-DNA נשמר רק כאשר קיבוע בדגימות קפואות טבעיות ובפורמלין ניטרלי מצופה בופר. השימוש בקיבוע חומצי חזק של Bouin או בפורמלין לא מצופה המכיל חומצה פורמית הביא לאובדן משמעותי של DNA. המקטע הנותר מקוטע מאוד.
משמאל, אורך הפרגמנטים מבוטא בזוגות קילובאזים (kbp)

איור 2 | אובדן שלמות של מטרות חומצות גרעין
(א) פער של 3′-5′ בשני הגדילים יגרום לשבירה ב-DNA המטרה. סינתזה של DNA עדיין תתרחש על הפרגמנט הקטן. עם זאת, אם אתר חישול פריימר חסר על פרגמנט ה-DNA, מתרחשת רק הגברה ליניארית. במקרה הנוח ביותר, הפרגמנטים עשויים להרוות מחדש זה את זה, אך התפוקות יהיו קטנות ונמוכות מרמות הגילוי.
(ב) אובדן בסיסים, בעיקר עקב דפורינציה ויצירת דימרים של תימידין, מוביל לירידה במספר קשרי המימן ולירידה ב-Tm. במהלך שלב ההתחממות המוארך, הפריימרים יימסו מה-DNA של המטריצה ​​ולא יתמזגו גם בתנאים פחות מחמירים.
(ג) בסיסי תימין סמוכים יוצרים דימר TT.
בעיה נפוצה נוספת המתרחשת לעתים קרובות באבחון מולקולרי היא שחרור לא אופטימלי של חומצות גרעין מטרה בהשוואה לחילוץ באמצעות פנול-כלורופורם. במקרים קיצוניים, הדבר יכול להיות קשור לתוצאות שליליות שגויות. ניתן לחסוך זמן רב על ידי ליזיס רותח או עיכול אנזימטי של שאריות תאים, אך שיטה זו גורמת לעיתים קרובות לרגישות נמוכה של PCR עקב שחרור לא מספק של חומצות גרעין.

עיכוב פעילות פולימראז במהלך הגברה

באופן כללי, עיכוב משמש כמושג מכל לתיאור כל הגורמים המובילים לתוצאות PCR לא אופטימליות. במובן ביוכימי גרידא, עיכוב מוגבל לפעילות האנזים, כלומר, הוא מפחית או מונע המרה של סובסטרט-תוצר באמצעות אינטראקציה עם האתר הפעיל של ה-DNA פולימראז או הקו-פקטור שלו (למשל, Mg2+ עבור Taq DNA פולימראז).
רכיבים בדגימה או בופרים ותמציות שונות המכילות ריאגנטים יכולים לעכב ישירות את האנזים או ללכוד את הקו-פקטורים שלו (למשל EDTA), ובכך להשבית את הפולימראז ובתורו להוביל לתוצאות PCR מופחתות או שליליות שגויות.
עם זאת, אינטראקציות רבות בין רכיבי התגובה לבין חומצות גרעין המכילות מטרה מסווגות גם כ"מעכבי PCR". ברגע ששלמות התא מופרעת על ידי בידוד וחומצת הגרעין משתחררת, יכולות להתרחש אינטראקציות בין הדגימה לתמיסה הסובבת אותה ולפאזה המוצקה. לדוגמה, "נוזלים" יכולים להיקשר ל-DNA חד-גדילי או דו-גדילי באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות ולהפריע לבידוד ולניקוי על ידי הפחתת מספר המטרות המגיעות בסופו של דבר לכלי תגובת ה-PCR.
באופן כללי, מעכבי PCR קיימים ברוב נוזלי הגוף והריאגנטים המשמשים לבדיקות אבחון קליניות (אוריאה בשתן, המוגלובין והפרין בדם), תוספי תזונה (רכיבים אורגניים, גליקוגן, שומן, יוני סידן 2+) ורכיבים בסביבה (פנולים, מתכות כבדות).

מעכבי PCR נפוצים יותר ניתן למצוא בחיידקים ובתאים אאוקריוטיים, ב-DNA שאינו מטרה, במקרומולקולות הקושרות DNA של מטריצות רקמה ובציוד מעבדה כגון כפפות ופלסטיק. טיהור חומצות גרעין במהלך או אחרי החילוץ הוא השיטה המועדפת להסרת מעכבי PCR.
כיום, ציוד מיצוי אוטומטי מגוון יכול להחליף פרוטוקולים ידניים רבים, אך שחזור ו/או טיהור של 100% של מטרות מעולם לא הושגו. מעכבים פוטנציאליים עשויים עדיין להימצא בחומצות הגרעין המטוהרות או שכבר נכנסו לפעולה. קיימות אסטרטגיות שונות להפחתת השפעת המעכבים. בחירת הפולימראז המתאים יכולה להיות בעלת השפעה משמעותית על פעילות המעכב. שיטות מוכחות אחרות להפחתת עיכוב PCR הן הגברת ריכוז הפולימראז או יישום תוספים כגון BSA.
ניתן להדגים עיכוב של תגובות PCR באמצעות בקרת איכות פנימית (IPC).
יש לנקוט משנה זהירות בהסרת כל הריאגנטים והתמיסות האחרות בערכת המיצוי, כגון אתנול, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, איזופרופנול ופנול, מבודד חומצת הגרעין על ידי שלב שטיפה יסודי. בהתאם לריכוזם, הם עשויים להפעיל או לעכב PCR.