גורמי הפרעה בתגובות PCR

במהלך תגובת ה-PCR, לעתים קרובות נתקלים בכמה גורמים מפריעים.
בשל הרגישות הגבוהה מאוד של PCR, זיהום נחשב לאחד הגורמים החשובים ביותר המשפיעים על תוצאות PCR ויכול להפיק תוצאות חיוביות שגויות.
קריטיים לא פחות הם המקורות השונים המובילים לתוצאות שליליות-שגויות. אם חלק חיוני אחד או יותר של תערובת ה-PCR או תגובת ההגברה עצמה מעוכבים או מופרעים, ניתן לעכב את בדיקת האבחון. זה יכול להוביל ליעילות מופחתת ואף לתוצאות שליליות שגויות.
בנוסף לעיכוב, אובדן שלמות חומצת הגרעין היעד עלול להתרחש עקב תנאי משלוח ו/או אחסון לפני הכנת הדגימה. בפרט, טמפרטורות גבוהות או אחסון לא מספק עלולים להוביל לנזק של תאים וחומצות גרעין. קיבוע תאים ורקמות והטבעת פרפין הם גורמים ידועים לפיצול DNA ולבעיה מתמשכת (ראה איורים 1 ו-2). במקרים אלו, אפילו בידוד וטיהור מיטביים לא יעזרו.

איור 1 | השפעת אימוביליזציה על שלמות ה-DNA
אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז הראתה כי איכות ה-DNA שבודד מקטעי פרפין של נתיחות שלאחר המוות השתנתה במידה ניכרת. DNA באורכים ממוצעים שונים של קטעים היה קיים בתמציות בהתאם לשיטת הקיבוע. ה-DNA נשמר רק כאשר הוא מקובע בדגימות מקוריות קפואות ובפורמלין ניטרלי מבוקרת. השימוש בפורמלין המכיל חומצה בואין חומצית מאוד או פורמלין המכיל חומצה צורנית, הביא לאובדן משמעותי של DNA. השבר הנותר מקוטע מאוד.
בצד שמאל, אורך השברים מבוטא בזוגות קילובס (kbp)

איור 2 | אובדן שלמות של מטרות חומצות גרעין
(א) פער של 3′-5′ בשני הגדילים יגרום לשבירה ב-DNA המטרה. סינתזה של DNA עדיין תתרחש על הפרגמנט הקטן. עם זאת, אם חסר אתר חישול פריימר על קטע ה-DNA, רק הגברה ליניארית מתרחשת. במקרה הטוב ביותר, השברים עשויים להרוות זה את זה מחדש, אך התשואות יהיו קטנות ומתחת לרמות הזיהוי.
(ב) איבוד בסיסים, בעיקר עקב דפורינציה ויצירת דימר תימידין, מביא לירידה במספר קשרי H ולירידה ב-Tm. במהלך שלב ההתחממות המוארך, הפריימרים יימסו הרחק מה-DNA המטריצה ​​ולא יחלו אפילו בתנאים פחות מחמירים.
(ג) בסיסי תימין סמוכים יוצרים דימר TT.
בעיה שכיחה נוספת שמתרחשת לעתים קרובות באבחון מולקולרי היא שחרור פחות מאופטימלי של חומצות גרעין מטרה בהשוואה למיצוי פנול-כלורופורם. במקרים קיצוניים, זה יכול להיות קשור לתשלילים כוזבים. ניתן לחסוך זמן רב על ידי תמוגה רותח או עיכול אנזימטי של פסולת תאים, אך שיטה זו גורמת לרוב לרגישות PCR נמוכה עקב שחרור לא מספיק של חומצת גרעין.

עיכוב פעילות פולימראז במהלך הגברה

באופן כללי, עיכוב משמש כמושג מיכל לתיאור כל הגורמים המובילים לתוצאות PCR לא אופטימליות. במובן ביוכימי למהדרין, העיכוב מוגבל לפעילות האנזים, כלומר, הוא מפחית או מונע המרה של תוצר סובסטרט באמצעות אינטראקציה עם האתר הפעיל של ה-DNA פולימראז או הקופקטור שלו (למשל, Mg2+ עבור Taq DNA polymerase).
רכיבים בדגימה או מאגרים ותמציות שונים המכילים ריאגנטים יכולים לעכב ישירות את האנזים או ללכוד את הקופקטורים שלו (למשל EDTA), ובכך להשבית את הפולימראז ובתמורה להוביל לירידה או תוצאות PCR שליליות שגויות.
עם זאת, אינטראקציות רבות בין רכיבי תגובה וחומצות גרעין המכילות מטרה מוגדרות גם כ'מעכבי PCR'. ברגע ששלמות התא מופרעת על ידי בידוד וחומצת הגרעין משתחררת, יכולות להתרחש אינטראקציות בין הדגימה והתמיסה הסובבת אותה והשלב המוצק שלה. לדוגמה, 'סורקים' יכולים לקשור DNA חד או דו-גדילי באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות ולהפריע לבידוד וטיהור על ידי הפחתת מספר המטרות שיגיעו בסופו של דבר לכלי התגובה של PCR.
באופן כללי, מעכבי PCR קיימים ברוב נוזלי הגוף והריאגנטים המשמשים לבדיקות אבחון קליניות (אוריאה בשתן, המוגלובין והפרין בדם), תוספי תזונה (רכיבים אורגניים, גליקוגן, שומן, יוני Ca2+) ורכיבים בסביבה (פנולים). , מתכות כבדות)

מעכבי PCR נפוצים יותר יכולים להימצא בחיידקים ובתאים אאוקריוטיים, ב-DNA ללא מטרה, במאקרומולקולות קושרות DNA של מטריצות רקמות ובציוד מעבדה כגון כפפות ופלסטיק. טיהור של חומצות גרעין במהלך או אחרי מיצוי היא השיטה המועדפת להסרת מעכבי PCR.
כיום, ציוד מיצוי אוטומטי שונים יכול להחליף פרוטוקולים ידניים רבים, אך 100% התאוששות ו/או טיהור של מטרות מעולם לא הושגו. מעכבים פוטנציאליים עשויים עדיין להימצא בחומצות הגרעין המטוהרות או שאולי כבר השפיעו. קיימות אסטרטגיות שונות להפחתת ההשפעה של מעכבים. לבחירה בפולימראז המתאים יכולה להיות השפעה משמעותית על פעילות המעכבים. שיטות מוכחות אחרות להפחתת עיכוב PCR הן הגדלת ריכוז הפולימראז או יישום תוספים כגון BSA.
ניתן להדגים עיכוב של תגובות PCR על ידי שימוש בבקרת איכות תהליך פנימית (IPC).
יש להקפיד להסיר את כל הריאגנטים והתמיסות האחרות בערכת המיצוי, כגון אתנול, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol ופנול, מהבידוד של חומצת הגרעין על ידי שלב כביסה יסודי. בהתאם לריכוזם, הם עשויים להפעיל או לעכב PCR.